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而激進尊攘派中最大的集團長州藩則正策劃著更為危險的舉動，他們打算從內部擾亂進而佔領京都，挾制天皇，讓天皇下詔討伐江戶幕府——這一行動被稱為“奪玉”，“玉”指的就是當時在位的孝明天皇。
次年是元治元年（1864年），六月五日，負責京都治安的新選組逮捕了一名化裝成武具商的尊攘志士古高俊太郎，俊太郎受刑不過，供出當晚將有長州、土佐、肥後等脫藩志士二十餘人聚集在京都三條河原町的旅館池田屋開會，打算在京都縱火，然後趁亂攻入皇宮，奪取天皇。於是新選組在通報了京都守護職松平容保以後，快速展開行動，乘夜奇襲了池田屋，包括宮部鼎藏、吉田稔麿在內的七名志士被當場斬殺，其餘數人被逮捕——桂小五郎倒是僥倖逃得一命，被迫化裝成乞丐逃出京都。
“池田屋事變”，可以說是日本維新史上的一個重要轉折點，長州藩從此作為倒幕的急先鋒穩穩站在歷史的舞臺上。
新選組悲歌
“新選組”也寫作“新撰組”，是在文久三年（1863年）四月正式成立的。
且說會津藩主松平容保在前一年（1862年）的閏八月就任京都守護職，負責京都的治安，為了增強警備力量，他經過幕府的同意，授命鵜殿長銳、清川八郎、佐佐木只三郎等人招募浪人，組建了“浪士隊”。但因為浪士隊內部品流複雜，大量攘夷志士也蜂擁而入，使得容保等人害怕這支隊伍無法維持京都治安，反而變成動亂之源，於是在文久三年（1863年）年初將其取締，主力調往江戶，編成“新徵組”。
浪士隊被取締後，隊員芹澤鴨、近藤勇等人前往求見松平容保，陳述了自己對幕府的赤膽忠心，容保深受感動，就允許二人建立新選組。新選組設立之初由三駕馬車共同指揮，也即上面提到過的芹澤鴨和近藤勇，還有一位新見錦。然而到了當年的九月，內部紛爭暴起，首先是新見錦被勒令自殺，隨即芹澤鴨在與情人幽會島原料亭的時候，被近藤一黨的土方歲三、山南敬助、沖田總司等人刺殺。
從此近藤勇成為新選組的唯一首腦——局長，實際主導隊務的則是副長，人稱“智囊”的土方歲三。近藤勇出自武藏多摩地區，本是小劍術流派“天然理心流”第三代近藤周作的養子，後來繼承為第四代傳人，新選組內很多成員也都是他的同門。
當初德川家康建都江戶時，為防一旦有變，可以使後代將軍安全撤至甲府，因此採納了大久保長安的建議，在多摩八王子地方佈下一哨人馬，這哨人馬由原住民五百人，加上武田遺臣五百人組成，稱為“八王子千人隊”。傳說新選組中堅力量大多是八王子千人隊的後裔，因此對德川幕府秉持著強烈的忠義之心——六番組長井上源三郎已被證實確為這種身份。
新選組建立以後，即在京都各町巡邏，一開始的目的是捕拿妄圖鬧事的宵小，但因為很多尊攘志士都想在京都掀起紛亂，以便混水摸魚地奪“玉”，所以很快的，新選組就成為了尊攘派的死敵。元治元年（1864年）六月五日，發生了“池田屋之變”，新選組隨之名聲大噪。
新選組對內管理嚴格，法度森嚴，對外則行動迅速，血腥無情，在他們的管理下，京都治安略有好轉。然而隨著德川幕府的垮臺，新選組也日趨走向沒落。在倒幕維新的戊辰戰爭中的每一仗，幾乎都可以看到新選組成員的身影：先是伏見·鳥羽之戰，江戶無血開城後還有上野之戰、會津之戰和最後的箱館之戰。最終在新政府軍攻打五稜郭的時候，人稱“鬼副長”的土方歲三中彈身亡，標誌著新選組的徹底覆滅。
除土方歲三外，新選組的其他重要成員的下場是：近藤勇曾在關東地區組建甲陽鎮撫隊與新政府軍對抗，戰敗後被處以斬刑；一番隊長、劍術高手沖田總司在戊辰戰爭爆發後不久就因肺結核而死；參謀伊東甲子太郎和五番隊長武田觀柳齋等人在內部鬥爭中被整肅；總長山南敬助和八番隊長藤堂平助等人脫隊後遭到斬殺或被勒令切腹。
只有二番隊長永倉新八和三番隊長齋藤一僥倖活了下來。永倉新八在戊辰戰爭前就脫隊而去，自組“靖兵隊”與新政府軍對戰，會津戰爭後被赦免，恢復了松前藩籍。齋藤一曾在會津城下代替土方歲三指揮戰鬥，兵敗後遭到流放，戰爭結束後，他改名藤田五郎，進入警視局，退役後就任女子高等師範學校的校工，直到病歿。
●禁門之變
元治元年（1864年）六月五日爆發的“池田屋事變”，使得長州激進尊攘派的活動從地下轉入地上，毛利家三名尊攘派的家老——益
